高速冷凍離心機(jī)提取植物蛋白質(zhì)方法
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一、植物組織蛋白質(zhì)提取方法
1、根據(jù)樣品重量(1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入)，準(zhǔn)備提取液放在冰上。
2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置(3-4小時(shí))。
3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，樣品制備完成。
蛋白質(zhì)提取液：300ml
1、1Mtris-HCl(PH8)45ml
2、甘油(Glycerol)75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
這種方法針對(duì)SDS-PAGE，垂直板電泳！
二、植物組織蛋白質(zhì)提取過(guò)程
氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨葉片
2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過(guò)夜，然后離心(4℃8000rpm以上1小時(shí))棄上清。
3、加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇)，搖勻后離心(4℃8000rpm以上1小時(shí))，然后真空干燥沉淀，備用。
4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心(15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒(méi)有沉淀為標(biāo)準(zhǔn))，可臨時(shí)保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?BR>
藥品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中(終體積為5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
這種方法針對(duì)雙向電泳，雜質(zhì)少，離子濃度小的特點(diǎn)！當(dāng)然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會(huì)減少！
三、組織：腸黏膜
目的：WESTERNBLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：
含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min
離心：12000g，10min，4度，棄上清
加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)
振蕩，置室溫20min
離心：7500g，5min，4度，棄上清
重復(fù)0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次
沉淀中加入100％乙醇2ml
充分振蕩混勻，置室溫20min
離心：7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀
1％SDS溶解沉淀
離心：10000g，10min，4度
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)
存在的問(wèn)題：加入1％SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結(jié)晶？測(cè)濃度，含量才1mg/ml左右。
解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分鐘，效果很好的。
四、植物材料：水稻苗，葉鞘，根
1、200毫克樣品置于冰上磨碎
2、加lysisbuffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清
3、重復(fù)離心5min
lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40
五、蛋白質(zhì)樣品制備
秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等(1986)的方法進(jìn)行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸(丙酮配制，含10mM即0.07%β-巰基乙醇)，混勻，-20℃沉淀1小時(shí)，4℃，15000r/min離心15min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巰基乙醇)，再于-20℃沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，(有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。
按每mg干粉加入20μl(可調(diào))UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃溫育30min，期間攪動(dòng)幾次，28度(溫度低，高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰)16000r/min離心15min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳?；蛘?70度保存
六、植物根中蛋白質(zhì)的抽取
(1)sample,液氮研磨
(2)裝1.5mlcentrifuge用tube
(3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul
(4)12000rpm,4度,10-15minite
(5)取上層液，蛋白質(zhì)就在里面
1、根據(jù)樣品重量(1g樣品加入3.5ml提取液，可根據(jù)材料不同適當(dāng)加入)，準(zhǔn)備提取液放在冰上。
2、把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上靜置(3-4小時(shí))。
3、用離心機(jī)離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，樣品制備完成。
蛋白質(zhì)提取液：300ml
1、1Mtris-HCl(PH8)45ml
2、甘油(Glycerol)75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g
這種方法針對(duì)SDS-PAGE，垂直板電泳！
二、植物組織蛋白質(zhì)提取過(guò)程
氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨葉片
2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過(guò)夜，然后離心(4℃8000rpm以上1小時(shí))棄上清。
3、加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇)，搖勻后離心(4℃8000rpm以上1小時(shí))，然后真空干燥沉淀，備用。
4、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后離心(15℃8000rpm以上1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間以沒(méi)有沉淀為標(biāo)準(zhǔn))，可臨時(shí)保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分裝放入-80℃?zhèn)溆谩?BR>
藥品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中(終體積為5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
這種方法針對(duì)雙向電泳，雜質(zhì)少，離子濃度小的特點(diǎn)！當(dāng)然單向電泳也同樣適用，只是電泳的條帶會(huì)減少！
三、組織：腸黏膜
目的：WESTERNBLOT檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)
應(yīng)用TRIPURE提取蛋白質(zhì)步驟：
含蛋白質(zhì)上清液中加入異丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)
倒轉(zhuǎn)混勻，置室溫10min
離心：12000g，10min，4度，棄上清
加入0.3M鹽酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)
振蕩，置室溫20min
離心：7500g，5min，4度，棄上清
重復(fù)0.3M鹽酸胍/95％乙醇步2次
沉淀中加入100％乙醇2ml
充分振蕩混勻，置室溫20min
離心：7500g，5min，4度，棄上清吹干沉淀
1％SDS溶解沉淀
離心：10000g，10min，4度
取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)
存在的問(wèn)題：加入1％SDS后沉淀不溶解，還是很大的一塊，4度離心后又多了白色沉定，SDS結(jié)晶？測(cè)濃度，含量才1mg/ml左右。
解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分鐘，效果很好的。
四、植物材料：水稻苗，葉鞘，根
1、200毫克樣品置于冰上磨碎
2、加lysisbuffer，離心，10000rpm，4度，5min取上清
3、重復(fù)離心5min
lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40
五、蛋白質(zhì)樣品制備
秧苗蛋白質(zhì)樣品的提取按Davermal等(1986)的方法進(jìn)行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸(丙酮配制，含10mM即0.07%β-巰基乙醇)，混勻，-20℃沉淀1小時(shí)，4℃，15000r/min離心15min，棄上清，沉淀復(fù)溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巰基乙醇)，再于-20℃沉淀1小時(shí)，同上離心棄上清，(有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。
按每mg干粉加入20μl(可調(diào))UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫蘇糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃溫育30min，期間攪動(dòng)幾次，28度(溫度低，高濃度的尿素會(huì)讓溶液結(jié)冰)16000r/min離心15min，離心力越大時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)越好！上清即可上樣電泳?；蛘?70度保存
六、植物根中蛋白質(zhì)的抽取
(1)sample,液氮研磨
(2)裝1.5mlcentrifuge用tube
(3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul
(4)12000rpm,4度,10-15minite
(5)取上層液，蛋白質(zhì)就在里面
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