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矛尾復(fù)蝦虎魚病原哈氏弧菌的鑒定及特異性檢測(cè)方法的研究

摘 要：2009 年 8 至 9 月間，江蘇贛榆縣多家蝦蟹養(yǎng)殖塘混養(yǎng)的矛尾復(fù)蝦虎魚大量死亡，主要病變特征為體表出血、肌肉潰瘍，從矛尾復(fù)蝦虎魚深層潰爛組織及肝臟中分離出優(yōu)勢(shì)菌，通過(guò)感染實(shí)驗(yàn)表明了該菌對(duì)矛尾復(fù)蝦虎魚有很強(qiáng)的致病性，當(dāng)分離菌濃度在 106 至 108 可引起矛尾復(fù)蝦虎魚全部死亡。對(duì)分離菌進(jìn)行相關(guān)的形態(tài)及理化特性等生物學(xué)特性檢驗(yàn)，分析了 16S rRNA 和 gyrB 兩種基因序列的同源性，并采用 PAUP4.0 的最大簡(jiǎn)約法maximum parsimony，MP構(gòu)建了基于兩種基因的 MP 系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果表明引起矛尾復(fù)蝦虎魚大量死亡的病原為弧菌屬Vibrio的哈氏弧菌Vibrio harveyi。同時(shí)基于 gyrB 基因和 toxR 基因序列各設(shè)計(jì)了 1 對(duì)特異性引物，接著利用該兩對(duì)引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和敏感性檢測(cè)，最后進(jìn)行海產(chǎn)品的檢驗(yàn)，建立了一種哈氏弧菌快速、 在 敏感的 PCR 檢測(cè)方法。 PCR擴(kuò)增中，gyrB 基因引物 A2B3 擴(kuò)增目的片段大小為為 363bp，該方法最低能檢測(cè)0.0046875ng/μL 哈氏弧菌模板 DNA；toxR 基因引物 vh-tox-F、vh-tox-R 擴(kuò)增目的片段大小為為 390bp，該方法最低能檢測(cè) 0.75ng/μL 哈氏弧菌模板 DNA。基于哈氏弧菌的 gyrB 基因和 toxR 基因建立的 PCR 檢測(cè)技術(shù)在對(duì)由哈氏弧菌所引起的流行病的調(diào)查具有重要意義。

    矛尾復(fù)蝦虎魚（Synechogobius hasta）分類于鱸形目（Perciformes）、蝦虎魚科（Gobiidae）、復(fù)蝦虎魚屬，俗稱胖頭魚、海鲇魚、扔巴魚，暖溫性中小型底層雜食性魚類，耐溫性和耐鹽性超強(qiáng)。矛尾復(fù)蝦虎魚體延長(zhǎng)，前部亞圓柱形，尾部側(cè)扁。它的頭大，略扁平狀；吻中長(zhǎng)，圓鈍；口裂大，下頜微突出，齒小而細(xì)密；眼小，上側(cè)位，眼間隔寬平；體被圓鱗，尾部鱗大；背鰭兩個(gè)，相互分離；復(fù)鰭發(fā)育成吸盤狀，能固定于海床上，尾鰭尖長(zhǎng)。它的體表黃褐色，有不規(guī)則暗淡斑紋，體色隨棲息環(huán)境不同有所差異；腹部色淺，性成熟期呈淡黃色，復(fù)鰭泛紅。一般個(gè)體體長(zhǎng) 25cm-30 cm，尾重 150g-200g，最大個(gè)體長(zhǎng)可達(dá) 50cm 以上，尾重超過(guò) 500g。它們?yōu)榕瘻匦源笮臀r虎魚類的一種，分布于我國(guó)渤海、東海和朝鮮、日本沿岸及河口附近泥質(zhì)海區(qū)。它們以沙蠶、白蝦、鼓蝦和大眼蟹為主食亦攝食小型蝦虎魚、青鱗等仔、稚魚

1。近年來(lái)隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖矛尾復(fù)蝦虎魚戶逐漸增多，由于多種原因的共同影響，如藥物的濫用，底質(zhì)逐步老化，水域生態(tài)環(huán)境日趨惡化，加上管理措施不當(dāng)，使得魚病不斷爆發(fā)。病魚表現(xiàn)為身體發(fā)黃發(fā)瘦，彎曲成弓形，體表有大小不一的潰爛面，腸道內(nèi)化膿結(jié)節(jié)，許多內(nèi)部器官也發(fā)生肉眼可見的病變2。魚病引起的魚的死亡率達(dá) 70％以上，這給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了不可挽回的經(jīng)濟(jì)損失。 2009 年 8 至 9 月間，江蘇連云港贛榆縣多家蝦蟹養(yǎng)殖塘混養(yǎng)的矛尾復(fù)蝦虎魚大量死亡，主要病變特征為體表出血，肌肉潰瘍。我們從矛尾復(fù)蝦虎魚中深層潰爛組織及肝臟中分離到一種優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)菌，然后對(duì)其進(jìn)行生理生化和分子學(xué)鑒定，分析了 16S rRNA 和 gyrB 兩種基因序列的同源性，并采用 PAUP4.0 的最大簡(jiǎn)約法maximum parsimony，MP構(gòu)建了基于兩種基因的 MP 系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果表 明 引起矛尾復(fù)蝦虎魚大量死亡的病原為弧菌屬Vibrio的哈氏弧菌Vibrioharveyi Johnson and Shunk 1936；同時(shí)，以哈氏弧菌 gyrB 基因和 toxR 基因設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行 PCR 檢測(cè)和敏感性試驗(yàn)，建立哈氏弧菌特異性分子生物學(xué)檢測(cè)方法。

2 材料和試劑2.1 儀器與設(shè)備 儀器：數(shù)碼顯微鏡，型號(hào)為 DMD5-5，生產(chǎn)廠家為日本尼康公司；電泳儀型號(hào)為 DYY-2C，生產(chǎn)廠家為北京市六一儀器；水平凝膠電泳槽型號(hào)為 DYCP-31BN，生產(chǎn)廠家為北京市六一儀器廠；常規(guī) PCR 擴(kuò)增儀型號(hào)為 TGradient，生產(chǎn)廠家為德國(guó) Biometra 公司雙人單面凈化工作臺(tái)型號(hào)為 SW-CJ-2FD，生產(chǎn)廠家為蘇州凈化微波爐型號(hào)為 P7021TP-6，生產(chǎn)廠家為中國(guó) Galanz；立式壓力蒸汽滅菌器筒，型號(hào)為 01J203-04，生產(chǎn)廠家上海東亞壓力容器制造有限公司；恒溫?fù)u床，型號(hào)為 QYC 2102C，生產(chǎn)廠家為上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；電子天平，型號(hào)為 EL104，生產(chǎn)廠家為梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；冷藏冷凍箱，型號(hào)為 BCD-206TDZA，生產(chǎn)廠家為青島海爾股份有限公司；生化培養(yǎng)箱，型號(hào)為 SPX-250B-Z 型，生產(chǎn)廠家為上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；臺(tái)式高速離心機(jī)，型號(hào)為 TG16A-WS，生產(chǎn)廠家為上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司

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